跨膜蛋白研究中必看文章！CFPS引跨膜蛋白研究的新范式

更新時間：2025-10-17 點擊次數：89

一、跨膜蛋白研究

跨膜蛋白目前仍然是結構生物學中具挑戰性的靶點之一。它們參與多種生物過程，包括光合作用、呼吸、信號轉導、分子轉運和催化等。有文章報道，跨膜蛋白占大多數生物體蛋白質組的 20% 至 30%，占藥物靶標的 40% 以上。此外，全長跨膜蛋白的研究尤為重要，因為只有完整的三維結構才能真實反映其生物學功能與藥物結合特性。

G蛋白偶聯受體(GPCRs)、離子通道和轉運蛋白等跨膜蛋白家族的異常與癌癥、神經系統疾病、心血管疾病等重大人類疾病密切相關。這些疾病機制研究和藥物開發都依賴于對全長跨膜蛋白結構的精確解析。例如，大量研究表明5-HT1A 受體（GPCRs超家族成員）與正常焦慮樣行為的發展有關，該受體是抗抑郁藥（如丁螺-環酮）和抗焦慮藥的重要作用靶點。

圖1:（A）α-螺旋和β-桶跨膜蛋白的結構；（B）跨膜蛋白示意圖：G 蛋白偶聯受體（GPCR）、離子通道、轉運蛋白、受體。

【公司案例】：珀羅汀生物推出的全長跨膜5-HT1A受體蛋白（G蛋白偶聯受體超家族成員），完整保留天然構象與功能域。5-HT1AR（5-Hydroxytryptamine 1A Receptor）即 5 - 羥色胺 1A 受體，由 HTR1A 基因編碼，廣泛分布于中樞神經系統（如前額葉皮層、海馬、中縫核等）及外周組織（如胃腸道、血管內皮）。其結構包含七次跨膜域、胞外 N 端及胞內 C 端，C 端可與 Gi/o 蛋白偶聯，激活后抑制腺苷酸環化酶活性，降低 cAMP 水平，同時調控 Ca2?通道和 K?通道，介導神經信號傳遞。

圖2：表達條帶

二、跨膜蛋白研究的瓶頸

盡管跨膜蛋白研究意義重大，但其表達與純化一直是結構生物學和藥物開發領域的重大挑戰。傳統細胞表達系統面臨幾個關鍵瓶頸：

1.低表達水平：膜蛋白的天然豐度通常太低，無法分離出足夠量的物質用于功能和結構研究。在傳統的細胞表達系統（如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞）中，大量表達跨膜蛋白通常是非常困難的。

許多跨膜蛋白的高表達會對宿主細胞產生毒性，且其合成和插入膜的過程復雜，導致表達量極低，難以滿足結構研究（如結晶）所需的大量純化蛋白。

2.溶解性與穩定性問題：跨膜蛋白需要在脂質雙分子層中正確折疊，其疏水跨膜區在細胞質中易形成聚集體，導致錯誤折疊和非功能性蛋白。

3.難以穩定形式純化蛋白質：表達量低和穩定性問題直接導致了純化的困難。需要引入親和標簽（如His-tag）并進行多步純化，整個過程不僅得率低，而且蛋白容易在純化過程中降解。天然膜環境是通過其脂質組成和理化性質賦予膜蛋白相當大的穩定性。當溶解在去垢劑中時，許多膜蛋白會迅速變性并經常聚集從而無法純化。

這些限制使得全長跨膜蛋白的研究進展緩慢，許多重要的藥物靶點至今無法獲得高分辨率結構或足夠量的蛋白進行功能研究。

三、無細胞蛋白表達技術的突破性優勢

無細胞蛋白表達技術為克服上述瓶頸提供了創新性解決方案：

1.模擬跨膜環境：無細胞系統允許直接添加脂質體、納米圓盤或去污劑等膜模擬環境，使跨膜蛋白在合成的同時就能進入類膜結構，極大提高了正確折疊率。

2.毒性蛋白的高效表達：由于無細胞系統不受細胞生長限制，可以高效表達對細胞有毒性的跨膜蛋白。

3.靈活調控氧化還原環境：跨膜蛋白二硫鍵的形成對其穩定性至關重要。無細胞系統可精確調控氧化還原電位，促進二硫鍵的正確形成，而無需復雜的細胞工程改造。

4.快速篩選表達條件：無細胞系統可實現高通量條件優化，快速篩選適合特定跨膜蛋白表達的脂質/去污劑組合、分子伴侶和緩沖條件，大幅縮短優化周期。

5.同位素標記簡化：對于NMR研究，無細胞系統可輕松實現特異性氨基酸標記，解決了全長跨膜蛋白同位素標記的難題。

圖3:體內和體外生產重組膜蛋白的一般策略

四、應用前景與展望

無細胞蛋白表達技術已開始在全長跨膜蛋白研究中展現出巨大潛力。在結構生物學領域，該技術已幫助解析多個難表達GPCRs的全長結構；在藥物開發中，實現了膜蛋白陣列的高通量制備用于藥物篩選；在合成生物學中，推動了人工膜蛋白的設計與構建。

【公司案例】珀羅汀生物推出的全長跨膜 STING1蛋白（G蛋白偶聯受體超家族成員），嚴格保留天然構象與功能域。 STING1（stimulator of interferon genes 1，GPCRs）是先天免疫信號通路的核心調控因子，其功能異常與多種疾病密切相關：在自身免疫疾病中，STING1突變（如N188H）或UXT缺失可導致I型干擾素過度激活，引發系統性紅斑狼瘡（SLE）、皮膚血管病變（SAVI）等；在腫瘤中，STING1表達水平與預后呈雙向關聯，此外，STING1突變或表達水平亦可作為SLE等疾病的診斷標志物及腫瘤預后評估指標。

圖4:人 STING1 全長蛋白表達條帶

未來，隨著無細胞系統與微流控技術、人工智能的進一步結合，全長跨膜蛋白研究將迎來更快速的發展。特別是對于目前尚未攻克的超大分子量跨膜蛋白復合體、高度動態的轉運蛋白等"難表達"靶點，無細胞蛋白表達技術可能成為關鍵突破口。總之，無細胞蛋白表達技術正在重塑全長跨膜蛋白研究的格局，為理解生命基本過程和開發新一代跨膜蛋白靶向藥物提供了不可替代的技術支撐。

參考文獻：

Carpenter EP, Beis K, Cameron AD, Iwata S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Curr Opin Struct Biol. 2008;18(5):581-586. doi:10.1016/j.sbi.2008.07.001.
Ryu H, Fuwad A, Yoon S, et al. Biomimetic Membranes with Transmembrane Proteins: State-of-the-Art in Transmembrane Protein Applications. Int J Mol Sci. 2019;20(6):1437. Published 2019 Mar 21. doi:10.3390/ijms20061437.
Garcia-Garcia, Alvaro L et al. “5-HT(1A) [corrected] receptors in mood and anxiety: recent insights into autoreceptor versus heteroreceptor function." Psychopharmacology vol. 231,4 (2014): 623-36. doi:10.1007/s00213-013-3389-x.
Bill RM, Henderson PJ, Iwata S, et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nat Biotechnol. 2011;29(4):335-340. doi:10.1038/nbt.1833.
Rauh, Oliver et al. “Combining in vitro translation with nanodisc technology and functional reconstitution of channels in planar lipid bilayers." Methods in enzymology vol. 652 (2021): 293-318. doi:10.1016/bs.mie.2021.02.003.
Schwarz, Daniel et al. “Production of membrane proteins using cell-free expression systems." Proteomics vol. 8,19 (2008): 3933-46. doi:10.1002/pmic.200800171.